El Horno erectus, por el simple hecho de erguirse sobre sus piernas, pudo alzar la mirada y ampliar sus horizontes prehistóricos. Mucho tiempo después, esa misma curiosidad por ver y conocer más y mejor condujo, al ya Horno sapiens, a la invención del telescopio, para observar objetos lejanos como los astros celestes, y a la creación del microscopio, para escudriñar la estructura de los objetos más pequeños.
El ojo humano distingue con dificultad elementos cuyo tamaño no supere la décima parte de un milímetro, como por ejemplo una pulga. Para observar microorganismos o células es imprescindible utilizar un microscopio convencional u óptico, aunque para obtener una imagen nítida de un virus ya es necesario recurrir al más fino elemento de "visión" existente en la actualidad: el microscopio electrónico.
Los hermanos holandeses Ham y Zacharias Janssen revolucionaron el mundo científico en 1590 construyendo el primer microscopio óptico. Estaba compuesto por dos lentes combinadas que conseguían una ampliación apenas superior a la de una lupa, aunque sus imágenes eran todavía muy borrosas. La fuente de luz era, por supuesto, la luz solar. En 1676, el artesano pañero Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), holandés sin formación científica pero dotado de un inmenso entusiasmo, construyó el primer microscopio óptico simple, es decir, de una sola lente pero tan-bien pulida que ya le permitió ver cosas tan pequeñas como las bacterias, los espermatozoides, piojos, etc. Tal fue la importancia del descubrimiento del microscopio óptico que su hegemonía en solitario se prolongó durante casi 400 años, permitiendo, entre otras muchas cosas, que Pasteur demostrara que las infecciones eran producidas por microbios.
Desde que a final del siglo XVI se fabricara aquel primer microscopio óptico, pasaron casi 350 años hasta que, en 1931, los físicos alemanes Ernst Ruska y Max Knoll construyeran el primer microscopio electrónico a partir de un hilo incandescente por el paso de una corriente eléctrica. Se basaron en los ya por entonces conocidos principios de electromagnetismo. Este hallazgo le valió el Premio Nóbel a Ruska en 1986. Su artilugio funcionaba mediante el bombardeo de la muestra con electrones, que formaban una imagen en una pantalla.
Se trataba ciertamente de un aparato novedoso, pero aún proporcionaba un aumento menor que los microscopios ópticos del momento. Afortunadamente, su desarrollo se produjo con gran celeridad, y sólo un año después ya se había superado el límite de resolución de los microscopios ópticos. En la actualidad, se han llegado a alcanzar potenciales de aceleración de electrones de hasta 1.250.000 voltios (una tensión más de cinco mil veces superior a la de los enchufes de nuestras casas), lo cual se traduce en un poder de resolución de 1 angstrom (un metro se divide en - 10.000 millones de angstroms).
El hallazgo de Ruska y Knoll se completó en 1965 con el desarrollo del microscopio electrónico de barrido y, más recientemente, con el de efecto túnel (1981) y el de fuerza atómica 0985), dos técnicas que ya no están basadas en principios ópticos tradicionales 'sino en las más recientes teorías electromagnéticas.
A pesar del cambio de teorías y principios con respecto al microscopio óptico, y del enorme salto tecnológico, un microscopio electrónico es en definitiva un instrumento para aumentar cosas demasiado pequeñas para ser observadas a simple vista. Los principios básicos implicados en dicha ampliación son los mismos que los de los microscopios de luz desde hace ya más de 400 años. La diferencia fundamental es que la menor longitud de onda de los electrones en comparación con la luz visible conlleva mayor poder de resolución, capacidad de ampliación y profundidad de campo. Los electrones ofrecen además otras considerables ventajas adicionales, pues son partículas cargadas negativamente que pueden ser desviadas de su trayectoria al ser sometidas a campos electromagnéticos. La fabricación de "lentes electromagnéticas", que sustituyen a las lentes convencionales de vidrio, es la clave de este gran avance.
El haz de electrones es la "luz" que se utiliza para "ver" en un microscopio electrónico. Una de las principales características del haz de electrones es su longitud de onda (si estuviéramos hablando de un haz de luz visible, su longitud de onda determinaría su color), la cual depende principalmente de la diferencia de potencial generada en el cañón del microscopio. Cuanto menor sea la longitud de onda de los electrones, seremos capaces de resolver distancias más pequeñas. Así, en un microscopio con potencial de aceleración de 100.000 voltios (100kV), la longitud de onda se sitúa en 0,0370 angstroms, suficiente para el campo de la Biología, mientras que en uno de 1.250 kV; la longitud de onda es de 0,0074 angstroms, lo cual hace interesante su uso en campos como la Nanotecnología, por la posibilidad de resolver distancias a nivel atómico. Hoy, las mejoras incluidas en la fuente de electrones y en las lentes están ampliando las prestaciones de microscopios de voltaje intermedios (200 o 300 kV).
Actualmente existen dos tipos de microscopios electrónicos: el de barrido y el de transmisión. El microscopio electrónico de barrido proporciona imágenes de la morfología externa de las muestras similares a las captadas por el ojo humano, mientras que el microscopio electrónico de transmisión informa sobre la estructura interna de los sólidos.
El desarrollo de microscopios electrónicos se supera día a día cumpliendo los requisitos necesarios para extraer de las muestras información estructural, superficial e incluso química, tanto de sustancias orgánicas como inorgánicas. La combinación de microscopia electrónica de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) y las respectivas técnicas de análisis químico permite resolver problemas que hasta hace poco eran impensables en campos como la Nanotecnología o la Biotecnología. A modo de ejemplos, la microscopia electrónica se utiliza para localizar y analizar pequeñas partículas necesarias para el adecuado funcionamiento de los catalizadores de los coches. En el estudio de la estructura porosa de las zeolitas, minerales empleados como intercambiadores iónicos (por ejemplo en detergentes de lavadora) y filtros moleculares industriales, la combinación de SEM y TEM ha permitido "visualizar" transformaciones de fase que antes sólo era posible intuir. y el análisis de la composición química de las capas de pintura de un cuadro permite datarlo e incluso detectar falsificaciones.
Sensibles y sofisticados
Las diferencias en algunos de los componentes principales de los microscopios electrónicos delimitan sus posibles utilidades. Tal es el caso de la fuente de electrones, determinante del brillo y coherencia del haz, que puede ser: bien la clásica emisión termoiónica (que precisa altas temperaturas); o bien la denominada emisión de campo (en la que un campo eléctrico fuerte se añade a las altas temperaturas). Es esta última fuente, la emisión de campo, la más utilizada en la actualidad en Ciencia de Materiales.
Los electrones emitidos por cualquiera de las dos fuentes interaccionan con suma facilidad en el interior del microscopio con los gases que atraviesan, por lo que es necesario conseguir un ambiente con niveles de alto vacío a presiones del orden de una mil millonésima de atmósfera (106 torricellis). Un sistema especial se encarga de mantener tan altos valores de vacío, mediante una bomba rotatoria que opera en serie con una difusora conectada, por último, a otra iónica. Por otra parte, es precisa también la refrigeración constante de las lentes electromagnéticas del microscopio, de sus bombas y de sus fuentes de alimentación, para lo cual se utiliza un sistema de refrigeración de agua a 15 grados centígrados en circuito cerrado.
Por si la complejidad constructiva no fuera suficiente, además es necesario ubicar estos equipos en habitaciones aisladas (incluso arquitectónicamente hablando), isotermas y de dimensiones determinadas. Y no por capricho: incluso una ligera modificación en la intensidad de la corriente de ventilación de una habitación que hospeda un microscopio electrónico de alta resolución puede alterar la resolución final de las imágenes, impidiendo alcanzar un resultado óptimo.
Por último, la preparación de las muestras es vital para el resultado final, pues la técnica a emplear no debe afectar a lo que se quiere observar o medir y, de hacerlo, ha de conocerse de antemano el efecto que ello tendrá. Hoy, existen equipos capaces de trabajar en bajo vacío -en los que las muestras pueden introducirse sin fijar ni metalizar- e incluso en modo ambiental -para muestras húmedas-.
En un microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscopy), el haz pasa a través de las lentes condensadoras y de objetivo; después, unas bobinas desvían el haz para realizar un barrido a lo largo de la muestra; finalmente, un detector cuenta el número de electrones secundarios de baja energía emitidos por cada punto de la superficie.
En un microscopio electrónico de transmisión o TEM (Transmission Electron Microscopy), la muestra es iluminada por un haz de electrones producidos en el cañón situado en la parte superior del microscopio. Cuando los electrones son emitidos en un TEM desde el filamento pasan a través de una gran diferencia de potencial (voltaje de aceleración) y adquieren una considerable energía cinética, lo que les permite "atravesar" literalmente la muestra. La imagen en este caso se forma a partir de los electrones que son capaces de atravesar la muestra y alcanzar el detector.
En el microscopio de transmisión, que es probablemente el que mayor complejidad técnica incorpora, el haz pasa a través de la muestra cristalina que se desea analizar, lo que provoca que los electrones del haz "choquen" y sean dispersados o reflejados por los planos del cristal, dando como resultado el denominado patrón de difracción y la correspondiente imagen. El análisis del diagrama de difracción de electrones obtenido desvela la estructura íntima de la muestra. A pesar de las complejas transformaciones matemáticas que relacionan la difracción con la imagen, en la mayoría de los casos no es posible asociar directamente la imagen obtenida en el microscopio con la estructura molecular del objeto. Pero con ayuda de otras técnicas complementarias, y sobre todo gracias a la experiencia en simulación de imágenes y al saber de los científicos, se puede llegar a hacer una correcta interpretación de las micrografías.
Tercer milenio, Martes 01/julio/2004
Isabel Díaz es doctora en químicas y trabaja en el instituto de catálisis
y petroleoquímica del CSIC (Madrid)
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Creada.....: martes, 01 de junio de 2004
Modificada.: martes, 01 de junio de 2004
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